扩展青霉脂肪酶的定向进化及稳定性的提高

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扩展青霉脂肪酶的定向进化及稳定性的提高
论文目录
 
中文摘要第1-4页
Abstract第4-6页
中文文摘第6-13页
绪论第13-35页
  1.1 简介第13-21页
    1.1.1 蛋白质的热稳定性第13页
    1.1.2 蛋白质热稳定性类型第13-14页
    1.1.3 热稳定性蛋白酶的优点第14页
    1.1.4 热稳定性酶的应用第14-15页
    1.1.5 酶的热失活第15页
    1.1.6 影响蛋白质热稳定性的因素第15-21页
      1.1.6.1 疏水相互作用第16页
      1.1.6.2 氢键第16页
      1.1.6.3 盐桥第16-17页
      1.1.6.4 二硫键第17页
      1.1.6.5 芳香环的相互作用第17页
      1.1.6.6 包装效率第17-18页
      1.1.6.7 稳定的α-螺旋结构第18页
      1.1.6.8 氨基酸的组成第18-20页
      1.1.6.9 不稳定区域的锚定第20页
      1.1.6.10 寡聚化第20页
      1.1.6.11 亚基之间的相互作用第20-21页
      1.1.6.12 翻译后修饰第21页
      1.1.6.13 与金属离子结合第21页
  1.2 酶稳定性改造的策略和研究进展第21-28页
    1.2.1 理性设计第21-23页
    1.2.2 非理性设计第23-27页
    1.2.3 半理性设计第27-28页
  1.3 定向进化筛选策略第28-32页
    1.3.1 表型观察选择和筛选第28-29页
    1.3.2 微孔板滴定法第29页
    1.3.3 各种展示技术第29-31页
    1.3.4 流式细胞分选技术第31-32页
  1.4 B因子简介第32页
  1.5 本课题研究的思路及意义第32-35页
第一章 扩展青霉脂肪酶83,92及151位点突变体文库的构建和筛选第35-47页
  1.1 前言第35页
  1.2 材料第35-36页
    1.2.1 菌株与质粒第35页
    1.2.2 主要试剂第35-36页
    1.2.3 主要仪器第36页
    1.2.4 主要试剂及培养基配置第36页
  1.3 实验方法第36-41页
    1.3.1 设计寡核苷酸引物第36-37页
    1.3.2 重组质粒PET-47b(+)-PEL的构建第37-38页
    1.3.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及质粒的转化第38-40页
    1.3.4 脂肪酶突变体的筛选第40-41页
    1.3.5 脂肪酶突变体的鉴定第41页
  1.4 结果第41-45页
    1.4.1 PET-47b(+)质粒验证第41页
    1.4.2 PET片段鉴定第41页
    1.4.3 PET-47b(+)-PEL质粒鉴定第41-42页
    1.4.4 突变体质粒验证第42-43页
    1.4.5 稳定性提高突变体的筛选第43-45页
  1.5 讨论第45-47页
第二章 扩展青霉脂肪酶多拷贝基因工程菌的构建第47-57页
  2.1 前言第47页
  2.2 材料第47页
    2.2.1 菌体第47页
    2.2.2 主要试剂第47页
    2.2.3 主要仪器设备第47页
  2.3 实验方法第47-51页
    2.3.1 设计寡核苷酸引物第47-48页
    2.3.2 有EcoRⅠ酶切位点PEL片段的获得第48页
    2.3.3 pAO815质粒提取第48页
    2.3.4 一拷贝克隆载体pAO815-PEL的构建第48-49页
    2.3.5 TOP10感受态的制备和转化第49页
    2.3.6 重组质粒pAO815-PEL的鉴定第49-50页
    2.3.7 多拷贝表达载体pAO815-xlip的构建第50-51页
  2.4 结果与分析第51-54页
    2.4.1 pAO815-LIP单拷贝表达载体的构建第51页
    2.4.2 多拷贝表达载体pAO815-XLIP的构建第51-54页
  2.5 讨论第54-57页
第三章 多拷贝基因工程菌的脂肪酶表达及酶学性质的研究第57-79页
  3.1 前言第57-58页
  3.2 材料第58-59页
    3.2.1 菌株第58页
    3.2.2 主要试剂第58页
    3.2.3 主要仪器第58-59页
  3.3 实验方法第59-61页
    3.3.1 毕赤酵母GS115感受态的制备与转化第60-61页
    3.3.2 重组酵母的鉴定及诱导表达第61页
    3.3.3 SDS-PAGE鉴定第61页
  3.4 重组酵母脂肪酶酶学性质测定第61-63页
    3.4.1 测重组酵母脂肪酶酶活第61-62页
    3.4.2 重组酵母脂肪酶的酶活单位定义第62页
    3.4.3 对硝基苯酚的标准曲线测定第62页
    3.4.4 用不同浓度的乙醇处理测突变脂肪酶的稳定性第62页
    3.4.5 用相同浓度的乙醇处理不同时间测突变脂肪酶的稳定性第62页
    3.4.6 用相同浓度的不同有机溶剂处理测突变脂肪酶的稳定性第62页
    3.4.7 用不同温度处理测突变脂肪酶的稳定性第62-63页
    3.4.8 在40℃处理不同的时间测突变脂肪酶的稳定性第63页
  3.5 实验结果与分析第63-71页
    3.5.1 多拷贝基因工程菌GS-pAO815-xlip的筛选第63-64页
    3.5.2 脂肪酶的诱导表达第64-65页
    3.5.3 对硝基苯酚标准曲线第65-66页
    3.5.4 突变脂肪酶比活力分析第66页
    3.5.5 突变脂肪酶稳定性测定第66-71页
  3.6 分析与讨论第71-79页
第四章 总结与展望第79-83页
  4.1 创新点第79页
  4.2 总结第79-81页
  4.3 展望第81-83页
参考文献第83-91页
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果第91-93页
致谢第93-95页
个人简历第95-99页

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